一、什么是熒光標記？

   熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當從激發(fā)態(tài)恢復基態(tài)時，發(fā)出熒光。熒光標記技術指利用熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標記的無放射物污染，操作簡便等優(yōu)點，使得熒光標記物在許多研究領域的應用日趨廣泛。二、熒光標記的作用

  熒光標記物質在蛋白的功能研究、藥物篩選等領域也有著廣泛的應用。人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的熒光修飾，同樣是多肽合成領域的重要內容。

  三、熒光標記的位點

  熒光標記物質可以直接和多肽的N端直接相連（如異硫氰酸熒光素的連接， 通常在多肽的N端和異硫氰酸熒光素直接插一個氨基乙酸或者β-丙氨酸。），或者在C端和賴氨酸（或半胱氨酸）的側鏈連接、或者在其它可以連接的位子連接。

  四、熒光標記的舉例

  4.1 FITC修飾 異硫氰酸熒光素（FITC）具有比較高的活性，通常來說，在固相合成過程中引入該種熒光基團相對于其他熒光素要更容易，并且反應過程中不需要加入活化試劑。FITC修飾的多肽通常主要有兩種形式：（1）在整條肽鏈N端接入FITC，并且在FITC之前接入一分子的Acp（6-氨基己酸），也稱烷基間隔器。反應中FITC與肽鏈上 ** 的-NH2反應，Acp的接入提供了六個碳的直鏈空間，大大降低了反應的空間位阻，提高了反應效率，降低了反應難度。其次，F(xiàn)ITC還與多肽結構中的-SH，側鏈-NH2反應，Acp的加入也降低了這種副反應發(fā)生的可能。此外，多肽在酸性環(huán)境條件下切割時，在N端接入FITC的多肽需要經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，這種過程通常都會伴隨最后一個氨基酸的切除，而烷基間隔器Acp的接入就避免了這一情況的發(fā)生。（2）在整條肽中的某個Lys側鏈接入FITC，Lys側鏈為末端為-NH2的四碳直鏈烷基，直接起到了降低空間位阻的作用。這種修飾方式能夠靈活的在整條肽中任何位置進行FITC修飾，而不僅僅局限于末端。

  (圖解FITC修飾)

  4.2 AMC修飾 7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）是一種應用廣泛的熒光標記試劑，例如，酶的痕量測定，酶的鑒定，激光染料的制備等多種用途，此外，C端用香豆素修飾的泛素分子也是研究蛋白質泛素化過程的重要探針。 與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進行：（1）AMC與肽鏈C端第一個氨基酸反應;（2）固相合成整條肽鏈（從第二個氨基酸開始），并且保留整條肽鏈的側鏈保護基和最后一個氨基保護基；（3）液相縮合AA-AMC與全保護的肽鏈；（4）切除保護基，完成肽鏈的修飾。

  (圖解AMC修飾)

  4.3 5-FAM修飾

  通常用于激光共聚焦顯微鏡和流式細胞技術的運用。

  4.4 Rhodamine B（羅丹明 B）修飾

  羅丹明B是眾多羅丹明染料中的一種，用于熒光測定。

  4.5 5-TAMRA 修飾

  5-TAMRA是用于標記肽和蛋白質的最流行的橙色熒光團之一。

  4.6 Cy 3和 Cy 5修飾

  Cy3 and Cy5 是高消光系數(shù)的染料。因此，它們特別適用于細胞內敏感的多肽定位實驗。它們的缺點是在多肽合成的環(huán)境中非常的不穩(wěn)定，因此合成的量相對低。

  Cy 3

  Cy5

  五、常見熒光物質波長和激發(fā)波長